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EIA07348Ca
犬E3 泛素连接酶 RFL(RFL)酶联免疫试剂盒
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别名：Rififylin; RING finger protein 167
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检测范围：0.156-10 ng/mL
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灵敏度：最低可检测犬E3 泛素连接酶 RFL(RFL)浓度为0.031ng/mL
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规格：96T
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保存条件：-20℃ 保存；短期（约 2 周）可置于 4℃
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保存用途：用于体外定量检测液体样本中的犬E3 泛素连接酶 RFL(RFL)
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应用：ELISA
说明书下载
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犬E3 泛素连接酶 RFL(RFL)酶联免疫试剂盒组分
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组分
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96人份
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48人份
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保存条件
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预包被板
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8×12
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8×6
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4℃ / -20℃
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标准品
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2瓶
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1瓶
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4℃ / -20℃
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生物素标记抗体 (1:100)
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1瓶
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1瓶
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4℃ / -20℃
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酶结合物(1:100)
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1瓶
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1瓶
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4℃ / -20℃
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样品稀释液
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1瓶
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1瓶
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4℃ / -20℃
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标准品稀释液
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1瓶
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1瓶
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4℃ / -20℃
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抗体稀释液
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1瓶
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1瓶
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4℃ / -20℃
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酶结合物稀释液
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1瓶
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1瓶
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4℃ / -20℃
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洗涤液 (1:25)
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1瓶
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1瓶
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4℃ / -20℃
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显色液A
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1瓶
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1瓶
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4℃ / -20℃
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显色液B
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1瓶
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1瓶
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4℃ / -20℃
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显色液C
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1瓶
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1瓶
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4℃ / -20℃
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说明书
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1 set
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1套
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RT
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注意
RT：室温；犬E3 泛素连接酶 RFL(RFL)标准品：冻干粉；显色液 A：避光保存
自备器材
- 酶标仪（配备 450 nm 检测波长滤光片，可选配 570 nm 或 630 nm 校正波长滤光片）
- 洗板机（可调节加液量，确保每孔加液 350 μL 且不溢出）
- 洁净操作台、生物安全柜、通风橱
- 高精度单道移液器（量程：0.5–10 μL、20–200 μL、200–1000 μL）
- 高精度多道移液器（8 道或 12 道，量程 50–300 μL）
- 37℃恒温培养箱
- 低温离心机
- 冰箱（4℃、-20℃、-86℃）
- 分析天平
- 剪刀、镊子、钳子等
- 酶标板混匀器、低频振荡器等
其他自备材料
- 离心管（规格：1.5 mL、5 mL 等）
- 一次性吸头（量程：0.5–10 μL、20–200 μL、200–1000 μL）
- 纯化水或蒸馏水
- 吸水纸
- 坐标纸
样本采集与制备
样本制备
01.血清
采集的全血置于 4℃ 冰箱过夜。以 1000–3000 rpm 离心 10 分钟，取上清，立即检测或于 -20℃/-80℃ 保存（1–3 个月）。
02.血浆
采用添加 EDTA、柠檬酸钠或肝素作为抗凝剂的血浆，充分混匀。以 1000–3000 rpm 离心 10 分钟，取上清，立即检测或于 -20℃/-80℃ 保存（1–3 个月）。
03.组织匀浆
取用 0.01 mol/L PBS 洗涤过的组织块，按 1 g 组织加入 5–10 mL 组织蛋白提取试剂的比例，在冰浴条件下混匀。充分匀浆后，以 5000–10000 rpm 离心 10 分钟，取上清立即检测，或于 -20℃/-80℃ 保存（1–3 个月）。
04.细胞培养上清
以 1000–3000 rpm 离心 10 分钟，取上清立即检测，或于 -20℃/-80℃ 保存（1–3 个月）。
05.尿液、腹水、脑脊液等
以 1000–3000 rpm 离心 10 分钟，取上清立即检测，或于 -20℃/-80℃ 保存（1–3 个月）。
注意事项
1.采血管必须无热原、无内毒素。
2.不建议使用溶血或高脂标本。
3.样本最终应清亮透明，所有颗粒物需经离心去除。
4.若样本不能立即使用，应按单次用量分装，于 - 20～-80℃冷冻保存，严格避免反复冻融。
5.通常需要对样本进行稀释优化，使其读数落在标准曲线有效范围内。建议大批量检测前先做预实验，确定是否需要稀释。
6.建议采集足量样本用于多次检测，避免因操作问题导致数据丢失。
7.采集及处理样本时必须穿戴防护用品（如手套、实验服、呼吸器等），并注意标本处理中的潜在风险。
8.标本处理应在维护良好的生物安全柜内进行。
实验准备
建议使用者充分了解待测样本的预期浓度范围。建议查阅相关学术文献中同类样本的浓度参考，并据此对样本进行适当稀释。1.请提前 20 分钟将ELISA试剂盒从冰箱取出，恢复至室温后开始实验。
2.浓缩洗涤液用双蒸水按 1:25 稀释，未用完的洗涤液放回试剂盒内保存。
3.标准品：向冻干粉标准品瓶中加入 1.0 mL 标准品稀释液，静置 30 分钟。待标准品完全溶解后，轻轻混匀并做好标记。
4.标准品稀释方法说明：取 7 支洁净离心管，分别标记 ②、③、④、⑤、⑥、⑦、⑧。每管加入 300 μL 标准品稀释液。从①管吸取 300 μL 至②管，混匀；再从②管吸取 300 μL 至③管，混匀；重复上述步骤至⑦管。⑧管为阴性对照。
5.复溶后的标准品储备液不可重复使用。
6.生物素化抗体：根据待检测孔位数取适量生物素化抗体，用抗体稀释液按 1:100 稀释。需提前 30 分钟配制，严禁重复使用。
7.酶结合物：根据待检测孔位数取适量酶结合物，用酶稀释液按 1:100 稀释。需提前 30 分钟配制，严禁重复使用。
显色液：显色液 A 与显色液 B 按 9:1 比例混合，提前 30 分钟配制。
实验步骤
实验步骤
结果计算
以标准品浓度为 X 轴，OD 值为 Y 轴，用平滑曲线连接各标准品坐标点。将样本 OD 值代入标准曲线方程，即可计算样本浓度。建议使用专业曲线拟合软件（如 Curve Expert 1.3）进行结果分析与计算。
性能指标
犬E3 泛素连接酶 RFL(RFL)酶联免疫试剂盒典型数据
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典型数据
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标准品1
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标准品2
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标准品3
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标准品4
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标准品5
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标准品6
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标准品7
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标准品8
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标准品浓度,ng/mL
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10
|
5
|
2.5
|
1.25
|
0.625
|
0.3125
|
0.15625
|
0
|
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OD1
|
3.192
|
1.709
|
1.022
|
0.586
|
0.326
|
0.203
|
0.116
|
0.067
|
|
OD2
|
3.192
|
1.658
|
1.012
|
0.568
|
0.326
|
0.205
|
0.117
|
0.066
|
|
AVERAGE
|
3.192
|
1.684
|
1.017
|
0.577
|
0.326
|
0.204
|
0.117
|
0.067
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犬E3 泛素连接酶 RFL(RFL)酶联免疫试剂盒标准曲线
试剂盒标准曲线
犬E3 泛素连接酶 RFL(RFL)酶联免疫试剂盒线性
为评估本检测方法的线性，向样本中加入高浓度的其它物种E3 泛素连接酶 RFFL，并用相应的校准品稀释液进行梯度稀释，使样本浓度落在检测的线性范围内。
犬E3 泛素连接酶 RFL(RFL)酶联免疫试剂盒回收率
在多种基质中，于检测范围内设置三个不同浓度水平进行加标，对E3 泛素连接酶 RFFL的回收率进行评价。
犬E3 泛素连接酶 RFL(RFL)酶联免疫试剂盒回收率
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基质
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范围 %
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平均值% 回收率
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血清(n=5)
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84-101
|
92.5
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EDTA血浆(n=5)
|
83-105
|
94
|
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细胞培养上清(n=5)
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90-112
|
101
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犬E3 泛素连接酶 RFL(RFL)酶联免疫试剂盒精密度
批内精密度（实验内精密度）将三份已知浓度的样本在同一块酶标板上重复检测 20 次，以评估批内精密度。
批间精密度（实验间精密度）将三份已知浓度的样本在 20 次独立实验中分别检测，以评估批间精密度。实验由至少两名技术人员使用两个批次的试剂组分完成。
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批内精密度
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批间精密度
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样品
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1
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2
|
3
|
1
|
2
|
3
|
|
n
|
20
|
20
|
20
|
20
|
20
|
20
|
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CV%
|
6.8
|
5.9
|
6.4
|
7.9
|
7.8
|
8.7
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结果判定
01. 各样本及标准品的 OD 值均应扣除空白孔 OD 值进行校正。
02.手工绘制标准曲线：以标准品浓度为Y 轴，对应 OD 值为X 轴绘制标准曲线，用平滑曲线连接各坐标点。将样本 OD 值代入标准曲线方程即可计算样本浓度。建议使用专业曲线拟合软件（如 Curve Expert 1.3）进行结果分析与计算。
03.若样本 OD 值高于标准曲线中最高浓度标准品的 OD 值，应对样本进行稀释（或进一步稀释）后重新检测。计算最终浓度时，将测得浓度乘以稀释倍数。
注意事项
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01标准品复溶后不可再次保存，复溶后请勿再次冻存。
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02因运输过程中振荡、倒置，试剂盒内各试剂瓶 / 管可能需要离心，使液体汇集于底部。可手动摇匀或 1000 rpm 离心 1 分钟。
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03标准品复溶后不可再次保存，复溶后请勿再次冻存。
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04浓缩洗涤液可能出现轻微结晶，稀释时可水浴助溶，配制洗涤液时必须完全溶解。
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05配制后的标准品仅限一次性使用，请勿重复使用已加样检测的标准品；如需重复实验，请使用另一支标准品。
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06仅使用本试剂盒配套试剂 / 组分，不得混用其他订单批次或不同试剂盒的组分。
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07确保试剂充分混匀。微孔板内试剂的充分混匀对结果准确性尤为重要，建议使用微量振荡器（最低频率）；若无振荡器，可手动轻轻圆周振荡 1 分钟。
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08实验开始前，务必使试剂盒恢复至室温。
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09标准品建议设置复孔或三复孔检测。
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10未使用的酶标板条放回铝箔袋，于 2～8℃ 保存（适用于短期内使用）。
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11显色剂对光敏感，避光保存与使用。
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12过期试剂盒禁止使用。
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13采用双波长检测时，波长设置为 450 nm 和 630 nm。
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14所有样本、洗涤液及废弃物均按生物危害废物处理。显色终止液 C 为 1 mol/L 硫酸，使用时注意安全。
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15样本必须使用移液器等仪器加样，实验前校准仪器以避免误差。加样应快速，建议控制在 5 分钟内完成，可使用多道移液器。
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16封板膜不可重复使用，若仅使用部分板条可按需裁剪，使用后立即丢弃。
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17每次实验均需重新绘制标准曲线。若样本浓度过高（OD 值高于最高浓度标准品孔），按一定倍数稀释，并在最终计算时乘以稀释倍数。
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18含叠氮钠（NaN₃）的样本不可检测，因 NaN₃会抑制辣根过氧化物酶（HRP）活性。
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19使用洗板机洗板时，每孔洗涤液体积应略大于 350 μL，确保加样针无堵塞；手工洗板时，吸水材料应洁净无污染，避免交叉污染。
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20加入显色终止液 C 终止反应后，10 分钟内读取 OD 值。
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21若设置复孔，采用复孔均值计算结果。
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22溶血样本可能导致假阳性，不适合使用本试剂盒检测。
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23实验过程中，环境湿度尽量控制在 60% 左右。
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24建议定期检查恒温设备及校准，确保孵育温度稳定在 37℃。